Após uma juventude passada em Turquel, perto de Alcobaça, como ajudante de farmácia, e de uma prática amadora de desenho dos monumentos da região, como os mosteiros de Alcobaça ou da Batalha, Sousa Lopes inscreve-se na Escola de Belas-Artes de Lisboa no ano lectivo de 1895 – 96, frequentando as aulas de pintura de Veloso Salgado. Ainda antes de acabar o curso, ganha em 1903 o pensionato Valmor e parte nesse ano para Paris, onde estuda na École Nationale des Beaux-Arts com Fernand Cormon. Paralelamente, frequenta a conhecida escola privada de pintura, de gosto mais ecléctico, a Académie Julian. Nesses anos, absorve sobretudo a técnica dos mestres impressionistas, que vê certamente no Museu do Luxemburgo, e que se adequava bastante ao seu temperamento de colorista. As viagens que faz a Veneza, em 1907 e 1908 têm grande impacto na sua pintura, tornando-lhe a paleta mais clara e sensível aos valores lumínicos. Mantendo atelier permanente em Paris, apresenta-se regularmente no Salon em 1906, 1907 e 1912, e no ano de 1915 é convidado pelo governo português a organizar a secção de Belas-Artes do pavilhão português da Exposição Panamá-Pacífico, em São Francisco, EUA, onde apresenta obras dos naturalistas portugueses, referências suas e da época, como José Malhoa, Columbano e João Vaz.
Em 1917, realiza a sua primeira exposição individual em Lisboa, com grande sucesso crítico e comercial, na Sociedade Nacional de Belas-Artes, constituindo-se já como uma verdadeira retrospectiva da sua carreira, onde apresenta 204 pinturas, entre desenhos e gravuras a água-forte. Nesse mesmo ano, com o país envolvido na I Guerra Mundial, Sousa Lopes parte para França como oficial-artista (o único que Portugal teve), com a missão de documentar a participação portuguesa na frente ocidental, produzindo no rescaldo do conflito um notável conjunto de águas-fortes e uma série de pinturas monumentais hoje instaladas no Museu Militar de Lisboa.
Na década de 1920, vivendo entre Paris e Lisboa, o pintor realiza uma série de viagens artísticas onde produz importantes obras. Esta década de febril actividade é apresentada na sua segunda individual realizada em Lisboa, novamente na SNBA, em 1927. Em 1929, é nomeado director do Museu Nacional de Arte Contemporânea, sucedendo a Columbano Bordalo Pinheiro, e a partir de então fixa-se definitivamente em Lisboa.
Na década de 1930, Sousa Lopes interessa-se pela recuperação da técnica da pintura a fresco, e em 1937, já encarregue pelo governo da execução de várias pinturas a fresco para o Salão Nobre da Assembleia da República, o artista viaja como bolseiro para Roma, com o intuito de aprofundar a técnica e colher os exemplos maiores de Rafael e Miguel Ângelo, e dos primitivos italianos. Trabalha até 1942 nesta obra, altura em que começa a sofrer de uma doença coronária que o irá vitimar dois anos depois. A maioria dos frescos será concluída por Joaquim Rebocho e Domingos Rebelo, a quem deixou instruções precisas antes de morrer.

Carlos Gonçalves